Фазы апоптоза. Апоптоз клеток: определение, механизм и биологическая роль Каспазы апоптоз

(от др.-греч απόπτωσις — опадение, ноябрь) — наиболее распространенный тип запрограммированной клеточной смерти. Другими словами — это совокупность клеточных процессов, приводящих к гибели клетки. В отличие от другого вида клеточной смерти — некроза — при апоптозе не происходит разрушения цитоплазматической клеточной мембраны и, соответственно, содержание клетки не попадает во внеклеточную среду. Характерным признаком является фрагментация ДНК в мижнуклеосомальних участках специфической ендонуклезою — CAD (caspase activated DNase) на фрагменты с размером, кратным 180-200 нуклеотидов. В результате апоптоза происходит образование апоптичних телец — мембранных везикул, содержащих цельные органеллы и фрагменты ядерного хроматина. Эти тельца поглощаются соседними клетками или макрофагами в результате фагоцитоза. Так как внеклеточный матрикс НЕ поражается клеточными ферментами, даже при большом количестве апоптозных клеток, воспаление не наблюдается.

Процесс апоптоза необходимо для физиологического регулирования количества клеток организма, для уничтожения старых клеток, для формирования лимфоцитов, которые не являются реактивными к своим антигенов (аутоантигенов), для осеннего опадения листьев растений, для цитотоксического действия Т-лимфоцитов киллеров, для эмбрионального развития организма (исчезновения кожных перепонок между пальцами у эмбрионов птиц) и другое.

Нарушение нормального апоптоза клеток приводит к неконтролируемому размножению клетки и появления опухоли.

Термин «апоптоз» был впервые употреблен 1972 Керром, Вилли и Керри, которые описали его как дополняющий, но противоположный митоза механизм регуляции популяции животных клеток.

Значение апоптоза

Апоптоз — неотъемлемая часть жизнедеятельности большинства многоклеточных организмов. Особенно важную роль он играет в процессах развития. Например конечности четвероногих закладываются как лопатообразные вырасти, а формирование пальцев происходит благодаря гибели клеток между ними. Также подлежат апоптоза больше не нужны клетки, таким образом частности разрушается хвост у головастиков во время метаморфоза. В нервной ткани позвоночных во время эмбрионального развития более половины нейронов погибают путем апоптоза сразу же после образования.

Также апоптоз является частью системы контроля за «качеством» клеток, он позволяет разрушать те из них, которые неправильно расположены, поврежденные, нефункциональные или потенциально опасные для организма. Примером могут быть T- и B-лимфоциты, которые погибают, если не несут полезных антиген-специфических рецепторов или несут аутореактивных. Путем апоптоза также умирает большинство лимфоцитов аткивованих при инфекции после ее преодоления.

У взрослых организмов одновременно регуляция пролиферации клеток и апоптоза позволяет поддерживать стали размеры целой особи и ее отдельных органов. Например, после вживавання препарата фенобарбитал, что стимулирует пролиферацию гепатоцитов, у крыс увеличивается печень. Однако, сразу же после прекращения действия этого вещества все лишние клетки подлежат апоптоза, в результате чего размер печени возвращается к нормальному.

Также апоптоз происходит, когда клетка «чувствует» большое количество внутренних повреждений, которые она не может репаруваты. Например, в случае повреждения ДНК клетка может трансформироваться в раковую, чтобы этого не произошло она, при нормальных условиях, «кончает жизнь самоубийством». Также погибает путем апоптоза большое количество клеток инфицированных вирусами.

Маркеры апоптичних клеток

Клетки, погибают путем апоптоза, можно распознать по ряду морфологических признаков. Они становятся меньше и более плотными (пикноз), округляются и теряют псевдоподии, в них разрушается цитоскелет, распадается ядерная мембрана, хроматин конденсируется и фрагментируется. На поверхности клеток появляется большое количество пузырьков, если клетки достаточно велики, то они распадаются на окружены мембранами фрагменты — апоптические тельца.

В апоптичних клетках кроме морфологических происходит также большое количество биохимических изменений. В частности ДНК разрезается специальными нуклеазами в линкерных участках между нуклеосомами на фрагменты равной длины. Поэтому при разделении всей ДНК апоптичнои клетки с помощью электрофореза можно наблюдать характерную «лесенку». Другой метод выявления фрагментации ДНК — мечения ее свободных концов с помощью метода TUNEL (T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling).

Изменения претерпевает также и плазматическая мембрана апоптичних клеток. При нормальных условиях отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин содержится только в ее внутреннем (возвращенном к цитозоля) слое, однако во время апоптоза он «перескакивает» в наружный листок. Эта молекула служит сигналом «съешь меня» для ближних фагоцитов. Фосфатидилсерин-индуцированное поглощение апоптичних клеток, в отличие от других типов фагоцитоза, не приводит к выделению медиаторов воспаления. Описанная изменение плазмалеммы лежит в основе еще одного метода обнаружения клеток, погибающих путем апоптоза — покраска анексином V, специфически связывается с фосфатидилсерина.

Во время гибели клеток путем апоптоза они также теряют электрический потенциал, при нормальных условиях существует на внутренних мембранах митохондрий. Это явление можно использовать для выявления апоптичних клеток с помощью положительно заряженных флуоресцентных красителей, в норме накапливаются внутри митохондрий благодаря отрицательному заряду на внутренней поверхности их внутренних мембран. Во время апоптоза уровень закрашивания митохондрий существенно снижается. Маркером апоптоза также служит высвобождение цитохрома c из митохондрий в цитозоль.

Каспазы — медиаторы апоптоза

Клеточные системы, обеспечивающие прохождение апоптоза, аналогичные у всех животных, центральное место в них занимает семья белков каспазы. Каспазы — это протеазы, имеющие в активном центре остаток цистеина, и разрезают свои субстраты по специфическому остатка аспарагиновой кислоты (отсюда название: c от cysteine и asp от aspartic acid). Каспазы синтезируются в клетке в виде неактивных прокаспаз, которые могут становиться субстратами для других, уже активированных каспаз, что режут их в одном или двух местах по остатку аспартата. Два образованные фрагменты — больший и меньший — соединяются между собой, формируя димер, что ассоциирует с таким же димером. Сформированный таким образом тетрамер и является активной протеазой, может разрезать белки-субстраты. Кроме участков, соответствующих большей и меньшей субъединицам, прокаспазы иногда также содержат ингибиторные продомен, которые деградируют после отщепления.

В результате расщепления и активации одних каспазы другими формируется протеалитичний каскад, который существенно усиливает сигнал и делает апоптоз с определенного момента необратимым процессом. Те прокаспазы, которые начинают этот каскад называются инициаторным, а их сусбтраты — эффекторными. После аткивации эффекторные каспазы могут расщеплять другие эффекторные прокаспазы или белки-мишени. К машиной эффекторных каспаз, что разрушаются при апоптоза относятся в частности белки ядерной ламины, розщелення которых приводит к распаду этой структуры. Также деградирует белок, при нормальных условиях подавляет эндонуклеазы CAD, вследствие этого начинается фрагментация ДНК. Расщепляются каспазами и белки цитоскелета и межклеточной адгезии, в результате чего апоптические клетки округляются и отсоединяются от соседних клеток, и таким образом становятся легче мишенью для фагоцитов.

Набор каспазы, необходимый для прохождения апоптоза зависит от типа ткани и пути, по которому активируется клеточная смерть. Например у мышей при «выключении» гена, кодирующего эффекторную каспазу-3, апоптоз не происходит в мозге, однако нормально протекает в других тканях.

Гены прокаспаз активны в здоровых клетках, а следовательно белки необходимы для протекания апоптоза постоянно присутствуют, нужна лишь их активация для запуска клеточного суицида. В состав инициаторных прокаспаз входит длинный продомен, содержащий CARD (caspase recruitment domain, домен привлечения каспазы). CARD позволяет инициаторным прокаспазы присоединяться к адаптерных белков образуя активационные комплексы, когда клетка получает сигнал, что стимулирует апоптоз. В активационных комплексах несколько молекул прокаспаз оказываются в непосредственной близости друг друга, чего достаточно для их перехода в активное состояние, после чего они разрезают друг друга.

Два лучше изучены сигнальные пути активации каскада каспазы в клетках млекопитающих называются внешний и внутренний (митохондриальный), каждый из них использует собственные инициаторным прокаспазы.

Пути активации апоптоза

Внешний путь

Клетка может получать сигнал, индуцирует апоптоз, извне, например, от цитотоксических лимфоцитов. В таком случае активируется так называемый внешний путь (extrinsic pathway), начинающийся с рецепторов смерти. Рецепторы смерти — это трансмембранные белки, принадлежащие к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (ФНО), например сам рецептор ФНО и рецептор смерти Fas. Они формируют гомотримеры, в которых каждый мономер имеет внеклеточный лиганд-связывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен смерти, через адаптерные белки привлекает и активирует прокаспазы.

Лиганды рецепторов смерти также гомотримерамы. Они родственны между собой и принадлежат к семейству сигнальных молекул фактора некроза опухолей. Например, цитотоксические лимфоциты несут на своей поверхности лиганды Fas, которые могут присоединяться к рецепторам смерти Fas на плазмалемме клеток-мишеней. В таком случае внутриклеточные домены этих рецепторов соединяются с адаптерним белками (FADD, Fas-associated death domain), а те в свою очередь привлекают инициаторным прокаспазы 8 и / или 10. В результате этой серии событий формируется сигнальный комплекс, индуцирует смерть, — DISC (death inducing signaling complex). После активации в этом комплексе инициаторным каспазы разрезают эффекторные прокаспазы и запускают апоптичнои каскад.

Многие клетки синтезируют молекулы, в определенной степени защищают их от активации внешнего пути апоптоза. Примером такой защиты может быть экспрессия так называемых рецепторов-приманок (decoy receptors), имеющих внеклеточные домены связывания лигандов, однако не цитоплазматических доменов сметри, а значит, не могут запускать апоптоза и конкурируют с обычными рецепторами смерти за лиганды. Клетки также могут продуцировать белки, блокирующие внешний путь апоптоза, например FLIP, похожий по структуре к прокаспаз 8 и 10, однако не протеалитичнои активности. Он подавляет связывание инициаторных прокаспаз с комплексом DISC.

Внутренний путь

Апоптоз также может запускаться изнутри клетки, например в случае ее травме, повреждению ДНК, недостатка кислорода, питательных веществ или внеклеточных сигналов выживания. У позвоночных этот сигнальный путь называется внутренним (intrinsic pathway) или митохондриальным, ключевым событием в нем является высвобождение определенных молекул с межмембранного пространства митохондрий. К таким молекул в частности принадлежит цитохром c, что в обычных условиях входит в электрон-транспортной цепи митохондрий. Цитохром c синтезируется митохондрии и выходит из нее благодаря формированию Митохондриальный апоптоз-индуцирующий канал (МАК) и выполняет регуляторную роль до наступления морфологических изменений, связанных с апоптозом. После выхода цитохрома с, происходит его связывание с адаптерним белком Apaf (apoptotic protease actiuating factor-l), вызывая Олигомеризация последнего в колесоподибну семичленну структуру, которая называется Апоптосома. Апоптосома привлекает и активирует инициаторным прокаспазу-9, которая затем может активировать инициаторным прокаспазы.

В некоторых клетках внешний путь апоптоза должен активировать внутренний для того чтобы эффективно уничтожить клетку. Внутренний путь строго регулируется белками семьи Bcl-2.

Регуляция внутреннего пути белками семьи Bcl-2

К семейству Bcl-2 принадлежат эволюционно консервативные белки, главной функцией которых является регуляция высвобождения цитохрома c и других молекул с мижмебранного пространства митохондрий. Среди них есть про-апоптические и анти-апоптические молекулы, которые могут взаимодействовать между собой в различных комбинациях, подавляя друг друга, баланс между их активностью и определять судьбу клетки.

Сейчас известно около 20 белков из этой семьи, все они содержат хотя бы один из четырех альфа-спиральных доменов гомологии Bcl2, называемых BH1-4 (bcl2 homology). Антиапоптични белки семьи Bcl2 содержат все четыре домены, к ним относятся сам Bcl-2, а также Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 и A1. Проапоптични белки делятся на две группы, члены первой из которых содержат три BH-домены (BH1-3), это в частности Bak, Bax и Bok (последний экспрессируется только в тканях репродуктивных органов). Наиболее многочисленной среди семьи Bcl-2 является вторая группа проапоптичних белков, которые содержат только домен BH3 (BH3-only), к ней относятся Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix / BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

При нормальных условиях (то есть, когда клетка не проходит апоптоза) антиапоптични белки, такие как Bcl-2 и Bcl-X L, связываются с проапоптичнимы белками BH123 (Bax и Bak) и не позволяют им полимеризоваться во внешней мембране митохондрий образуя поры. В результате действия определенного апоптичнои стимула в клетке активируются или начинают синтезироваться проапоптични белки, содержащие только домен BH3. Они в свою очередь ингибируют антиапоптични белки, снимая их угнетающее эффект на Bak и Bax, или напрямую взаимодействуют с последними и способствуют их олигомеризации и образованию пор. Вследствие пермеабилизации внешней мембраны в цитозоль попадает цитохром c, а также другие медиаторы апоптоза, такие как AIF (англ. Apoptosis inducing factor).

Например, при недостатке сигналов выживания в клетке при посредничестве MAP-киназы JNK активируется экспрессия BH3 белка Bim, что запускает внутренний путь апоптоза. В случае повреждения ДНК происходит накопление супрессора опухолей p53, который стимулирует транскрипцию генов, кодирующих BH3 белки Puma и Noxa, которые также обеспечивают прохождение апоптоза. Еще один BH3 белок — Bid обеспечивает связь между внешним и внутренним путями апоптоза. После активации рецепторов смерти и, как следствие, каспазы-8, последняя разрезает Bid с образованием усеченной формы tBid (truncated Bid), которая перемещается в митохонрий, где подавляет Bcl-2.

Видео по теме

Апоптоз – это программированная клеточная смерть (инициирующаяся под действием вне- или внутриклеточных факторов) в развитии которой активную роль принимают специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы . Он, в отличие от некроза активный процесс, требующий определенных энергозатрат . Первоначально пытались разграничить понятия «программированная клеточная гибель » и «апоптоз »: к первому термину относили устранение клеток в эмбриогенезе, а ко второму – программированную смерть только зрелых дифференцированных клеток. В настоящее время выяснилось, что никакой целесообразности в этом нет (механизмы развития клеточной гибели одинаковы) и два понятия превратились в синонимы, хотя это объединение и не бесспорно.

Прежде чем приступить к изложению материала о роли апоптоза для жизнедеятельности клетки (и организма) в норме и патологии, мы рассмотрим механизм апоптоза. Их реализацию можно представить в виде поэтапного развития следующих стадий:

1 стадия – стадия инициации (индукции) .

В зависимости от происхождения сигнала, стимулирующего апоптоз, различают:

внутриклеточные стимулы апоптоза . Среди них к наиболее известным относят – разные виды облучения, избыток Н + , оксид азота, свободные радикалы кислорода и липидов, гипертермия и др. Все они могут вызывать различные повреждения хромосом (разрывы ДНК, нарушения ее конформации др.) и внутриклеточных мембран (особенно митохондрий). То есть в данном случае поводом для апоптоза служит «неудовлетворительное состояние самой клетки» (Мушкамбиров Н.П., Кузнецов С.Л., 2003). Причем, повреждение структур клеток должно быть достаточно сильным, но не разрушительным. У клетки должны сохраниться энергетические и материальные ресурсы для активации генов апоптоза и его эффекторных механизмов. Внутриклеточный путь стимуляции программированной смерти клетки можно обозначить как «апоптоз изнутри »;

трансмембранные стимулы апоптоза , т.е., в этом случае он активируется внешней «сигнализацией», которая передается через мембранные или (реже) внутриклеточные рецепторы. Клетка может быть вполне жизнеспособной, но, с позиции целостного организма или «ошибочной» стимуляции апоптоза, она должна погибнуть. Этот вариант апоптоза получил название «апоптоз по команде ».

Трансмембранные стимулы подразделяются на:

«отрицательные » сигналы. Для нормальной жизнедеятельности клетки, регуляции ее деления и размножения необходимо воздействие на нее через рецепторы различных БАВ: факторов роста, цитокинов, гормонов. Среди прочих эффектов, они подавляют механизмы клеточной гибели. И естественно, дефицит или отсутствие данных БАВ активирует механизмы программированной смерти клетки;

«положительные » сигналы. Сигнальные молекулы, такие как ФНОα, глюкокортикоиды, некоторые антигены, адгезивные белки и др., после взаимодействия с клеточными рецепторами могут запускать программу апоптоза.

На клеточных мембранах находится группа рецепторов, в задачу которых передача сигнала к развитию апоптоза является основной, возможно даже единственной функцией. Это, например, белки группы DR (death receptos – «рецепторы смерти »): DR 3 , DR 4 , DR 5 . Наиболее хорошо изучен Fas-рецептор, появляющийся на поверхности клеток (гепатоцитах) спонтанно или под влиянием активации (зрелые лимфоциты). Fas-рецептор при взаимодействии с Fas-рецептором (лигандом) Т-киллера запускает программу смерти клетки мишени. Однако, взаимодействие Fas-рецептора с Fas-лигандом в областях, изолированных от иммунной системы, заканчивается гибелью самого Т-киллера (см. нижеигандом в областях, изолированных от иммунной системы, заканчивается гибелью самого Т-киллера ()ожно000000000000000000000000000).

Следует помнить, что некоторые сигнальные молекулы апоптоза, в зависимости от ситуации могут наоборот, блокировать развитие программированной смерти клеток. Амбивалентность (двойственное проявление противоположных качеств) характерна для ФНО, ИЛ-2, интерферона γ и др.

На мембранах эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, а так же клеток легкого и кожи обнаружены особые антигены-маркеры . На них синтезируются физиологические аутоантитела , и они, выполняя роль опсонинов , способствуют фагоцитозу этих клеток, т.е. гибель клеток происходит путемаутофагоцитоза . Выяснилось, что антигены-маркеры появляются на поверхности «старых» (прошедших свой путь онтогенетического развития) и поврежденных клетках, молодые и неповрежденные клетки их не имеют. Данные антигены получили название «антигены-маркеры стареющих и поврежденных клеток» или «белок третьей полосы». Появление белка третьей полосы контролируется геномом клетки. Следовательно, аутофагоцитоз можно рассматривать, как вариант запрограммированной гибели клеток .

Смешанные сигналы. Это сочетанное воздействие сигналов первой и второй группы. Например, апоптоз происходит с лимфоцитами, активированных митогоном (положительный сигнал), но не вступивших в контакт с АГ (отрицательный сигнал).

2 стадия – стадия программирования (контроля и интеграции механизмов апоптоза).

Для этой стадии характерно два, диаметрально противоположных процесса, наблюдающихся после инициации. Происходит либо:

реализация пускового сигнала к апоптозу через активацию его программы (эффекторами являются каспазы и эндонуклеазы);

блокируется эффект пускового сигнала апоптоза.

Различают два основных, но не исключающих друг друга, варианта исполнения стадии программирования (рис. 14):

Рис. 14. Каспазный каскад и его мишени

R– мембранный рецептор; К – каспазы;AIF– митохондриальная протеаза; Цит. С – цитохром с;Apaf-1 – цитоплазматический белок;IAPs– ингибиторы каспаз

1. Прямая передача сигнала (прямой путь активации эффекторных механизмов апоптоза минуя геном клетки) реализуется через:

адапторные белки. Например, так осуществляется запуск апоптоза Т-киллером. Он активирует каспазу-8 (адапторный белок). Аналогично может действовать и ФНО;

цитохром С и протеазу ΑIF (митохондриальная протеаза). Они выходят из поврежденной митохондрии и активируют каспазу-9;

гранзимы. Т-киллеры синтезируют белок перфорин, который образует каналы в плазмолемме клетки-мишени. Через эти каналы в клетку проникают протеолитические ферменты гранзимы , выделяемые все тем же Т-киллером и они запускают каскад каспазной сети.

2. Опосредованная передача сигнала. Она реализуется с помощью генома клетки путем:

репрессии генов, контролирующих синтез белков-ингибиторов апоптоза (гены Bcl-2, Bcl-XL и др). Белки Bcl-2 в нормальных клетках входят в состав мембраны митохондрий и закрывают каналы по которым из этих органоидов выходят цитохром С и протеаза AIF;

экспрессии, активации генов, контролирующих синтез белков-активаторов апоптоза (гены Bax, Bad, Bak, Rb, P 53 и др.). Они, в свою очередь активируют каспазы (к-8, к-9).

На рис. 14 представлена примерная схема каспазного принципа активации каспаз. Видно, что откуда бы не запускался каскад, его узловым моментом является каспаза 3. Она активируется и каспазой 8 и 9. Всего в семействе каспаз – более 10 ферментов. Локализуются в цитоплазме клетки в неактивном состоянии (прокаспазы). Положение всех каспаз в данном каскаде до конца не выяснено, поэтому на схеме ряд из них отсутствует. Как только активируются каспазы 3,7,6 (возможно и их другие типы) наступает 3 стадия апоптоза.

3 стадия – стадия реализация программы (исполнительная, эффекторная).

Непосредственными исполнителями («палачами» клетки) являются выше указанные каспазы и эндонуклеазы. Местом приложения их действия (протеолиза) служат (рис. 14):

цитоплазматические белки – белки цитоскелета (фодрин и актин). Гидролизом фодрина объясняют изменение поверхности клетки – «гофрирование» плазмолеммы (появление на ней впячиваний и выступов);

белки некоторых цитоплазматических регуляторных ферментов: фосфолипазы А 2 , протеинкиназы С и др.;

ядерные белки. Протеолиз ядерных белков занимает основное место в развитии апоптоза. Разрушаются структурные белки, белки ферментов репликации и репарации (ДНК-протеинкиназы и др.), регуляторные белки (рRb и др.), белки-ингибиторов эндонуклеаз.

Иннактивация последней группы – белков ингибиторов эндонуклеаз приводит к активации эндонуклеаз, второму « орудию » апоптоза . В настоящее время эндонуклеазы и в частности, Са 2+ , Мg 2+ -зависимая эндонуклеаза , рассматривается как центральный фермент программируемой смерти клетки. Она расщепляет ДНК не в случайных местах, а только в линкерных участках (соединительные участки между нуклеосомами). Поэтому хроматин не лизируется, а только фрагментируется, что определяет отличительную, структурную черту апоптоза.

Вследствие разрушения белка и хроматина в клетке формируются и от нее отпочковываются различные фрагменты – апоптозные тельца. В них находятся остатки цитоплазмы, органелл, хроматина и др.

4 стадия – стадия удаления апоптозных телец (фрагментов клетки).

На поверхности апоптозных телец экспрессируются лиганды, они распознаются рецепторами фагоцитов. Процесс обнаружения, поглощения и метаболизирования фрагментов погибшей клетки происходит сравнительно быстро. Это способствует избежать попадания содержания погибшей клетки в окружающую среду и тем самым, как отмечено выше, воспалительный процесс не развивается. Клетка уходит из жизни «спокойно», не беспокоя «соседей» («тихий суицид»).

Программированная клеточная гибель имеет важное значение для многих физиологических процессов . С апоптозом связаны:

поддержание нормальных процессов морфогенеза – запрограммированная смерть клеток в процессе эмбриогенеза (имплантации, органогенеза) и метаморфоза;

поддержание клеточного гомеостаза (в том числе ликвидация клеток с генетическими нарушениями и инфицированных вирусами). Апоптозом объясняется физиологическая инволюция и уравновешивание митозов в зрелых тканях и органах. Например, гибель клеток в активно пролиферирующих и самообновляющихся популяциях – эпителиоцитов кишечника, зрелых лейкоцитов, эритроцитов. Гормонально-зависимая инволюция – гибель эндометрия в конце менструального цикла;

селекция разновидностей клеток внутри популяции. Например, формирование антигенспецифической составляющей иммунной системы и управление реализацией ее эффекторных механизмов. С помощью апоптоза происходит выбраковка ненужных и опасных для организма клонов лимфоцитов (аутоагрессивных). Сравнительно недавно (Griffith T.S., 1997) показали значение программированной гибели клеток в защите «иммунологически привилегированных» зон (внутренние среды глаза и семенников). При прохождении гисто-гематических барьеров данных зон (что случается редко), эффекторные Т-лимфоциты гибнут (см. выше). Включение механизмов их смерти обеспечивается при взаимодействии Fas-лиганда барьерных клеток с Fas-рецепторами Т-лимфоцита, тем самым предотвращается развитие аутоагрессии.

Роль апоптоза в патологии и виды различных заболеваний связанных с нарушением апоптоза представлены в виде схемы (рис. 15) и таблицы 1.

Конечно, значение апоптоза в патологии меньше чем некроза (возможно, это связано с недостаточностью таких знаний). Однако, проблема его в патологии имеет и несколько иной характер: она оценивается по степени выраженности апоптоза — усиление или ослабление при тех или иных болезнях.

Процесс, при котором клетка может убивать сама себя, называется запрограммированной клеточной гибелью (ЗГК). Этот механизм имеет несколько разновидностей и играет важнейшую роль в физиологии различных организмов, особенно многоклеточных. Самой часто встречающейся и хорошо изученной формой ЗГК является апоптоз.

Что такое апоптоз

Апоптоз - это контролируемый физиологический процесс самоуничтожения клетки, характеризующийся поэтапным разрушением и фрагментацией ее содержимого с формированием мембранных пузырьков (апоптозных телец), впоследствии поглощаемых фагоцитами. Этот генетически заложенный механизм активируется под воздействием определенных внутренних или внешних факторов.

При таком варианте гибели клеточное содержимое не выходит за пределы мембраны и не вызывает воспаление. Нарушения в регуляции апоптоза приводят к серьезным патологиям, таким как неконтролируемые клеточные деления или дегенерация тканей.

Апоптоз представляет собой лишь одну из нескольких форм запрограммированной гибели клетки (ЗГК), поэтому отождествлять эти понятия ошибочно. К известным видам клеточного самоуничтожения относят также митотическую катастрофу, аутофагию и программированный некроз. Другие механизмы ЗГК пока не изучены.

Причины апоптоза клеток

Причиной запуска механизма запрограммированной клеточной гибели могут быть как естественные физиологические процессы, так и патологические изменения, вызванные внутренними дефектами или воздействием внешних неблагоприятных факторов.

В норме апоптоз уравновешивает процесс деления клеток, регулируя их количество и способствуя обновлению тканей. В таком случае причиной ЗГК служат определенные сигналы, входящие в систему контроля гомеостаза. С помощью апоптоза уничтожаются одноразовые или выполнившие свою функцию клетки. Так, повышенное содержание лейкоцитов, нейтрофилов и других элементов клеточного иммунитета по окончании борьбы с инфекцией устраняется именно за счет апоптоза.

Запрограммированная гибель является частью физиологического цикла репродуктивных систем. Апоптоз задействован в процессе оогенеза, а также способствует гибели яйцеклетки при отсутствии оплодотворения.

Классическим примером участия апоптоза клеток в жизненном цикле вегетативных систем является осенний листопад. Сам термин происходит от греческого слова apoptosis, что буквально переводится как "опадание".

Апоптоз играет важнейшую роль в эмбриогенезе и онтогенезе, когда в организме сменяются ткани и атрофируются определенные органы. Примером могут служить исчезновение перепонок между пальцами конечностей некоторых млекопитающих или отмирание хвоста при метаморфозе лягушки.

Апоптоз может быть спровоцирован накоплением дефектных изменений в клетке, возникших в результате мутаций, старения или ошибок митоза. Причиной запуска ЗГК могут быть неблагоприятная среда (недостаток питательных компонентов, дефицит кислорода) и патологические внешние воздействия, опосредованные вирусами, бактериями, токсинами и т. д. При этом если повреждающий эффект слишком интенсивен, то клетка не успевает осуществить механизм апоптоза и погибает в результате развития патологического процесса - некроза.

Морфологические и структурно-биохимические изменения клетки во время апоптоза

Процесс апоптоза характеризуется определенным набором морфологических изменений, которые с помощью микроскопии можно наблюдать в препарате ткани in vitro.

К основным признакам, характерным для апоптоза клеток, относят:

перестраивание цитоскелета;
уплотнение клеточного содержимого;
конденсацию хроматина;
фрагментацию ядра;
уменьшение объема клетки;
сморщивание контура мембраны;
образование пузырьков на клеточной поверхности,
деструкцию органоидов.

У животных эти процессы завершаются образованием апоптоцитов, которые могут быть поглощены как макрофагами, так и соседними клетками ткани. У растений формирования апоптозных телец не происходит, а после деградации протопласта сохраняется остов в виде клеточной стенки.

Помимо морфологических изменений, апоптоз сопровождается рядом перестроек на молекулярном уровне. Происходит повышение липазной и нуклеазной активностей, которые влекут за собой фрагментацию хроматина и многих белков. Резко увеличивается содержание сАМФ, изменяется структура клеточной мембраны. В растительных клетках наблюдается образование гигантских вакуолей.

Чем апоптоз отличается от некроза

Главное различие между апоптозом и некрозом заключается в причине клеточной деградации. В первом случае источником разрушения служат молекулярные инструменты самой клетки, которые работают под строгим контролем и требуют затрат энергии АТФ. При некрозе происходит пассивное прекращение жизнедеятельности из-за внешнего повреждающего воздействия.

Апоптоз - это естественный физиологический процесс, сконструированный таким образом, чтобы не вредить окружающим клеткам. Некроз - это неконтролируемое патологическое явление, возникающее в результате критических повреждений. Поэтому неудивительно, что механизм, морфология и последствия апоптоза и некроза во многом противоположны. Однако имеются и общие черты.

В случае повреждения клетки запускают механизм запрограммированной гибели в том числе для того, чтобы не допустить некротического развития. Однако недавние исследования показали, что существует иная непатологическая форма некроза, которую также отнесли к ЗГК.

Биологическое значение апоптоза

Несмотря на то что апоптоз приводит к клеточной гибели, его роль для поддержания нормальной жизнедеятельности всего организма очень велика. Благодаря механизму ЗГК осуществляются следующие физиологические функции:

поддержание баланса между пролиферацией и смертью клеток;
обновление тканей и органов;
устранение дефектных и "старых" клеток;
защита от развития патогенного некроза;
смена тканей и органов при эмбрио- и онтогенезе;
удаление ненужных элементов, выполнивших свою функцию;
устранение клеток, нежелательных или опасных для организма (мутантных, опухолевых, зараженных вирусом);
предотвращение развития инфекции.

Таким образом, апоптоз является одним из способов поддержания клеточно-тканевого гомеостаза.

Этапы клеточной смерти

То, что происходит с клеткой при апоптозе, является результатом сложной цепочки молекулярных взаимодействий между различными ферментами. Реакции проходят по типу каскада, когда одни белки активируют другие, способствуя постепенному развитию сценария гибели. Этот процесс можно разделить на несколько этапов:

Индукция.
Активация проапоптических белков.
Активация каспаз.
Разрушение и перестройка клеточных органелл.
Формирование апоптоцитов.
Подготовка клеточных фрагментов к фагоцитозу.

Синтез всех компонентов, необходимых для запуска, реализации и контроля каждого этапа заложен генетически, почему апоптоз и называют запрограммированной гибелью клетки. Активация этого процесса находится под строгим контролем регуляторных систем, включающих в том числе и различные ингибиторы ЗГК.

Молекулярные механизмы апоптоза клетки

Развитие апоптоза обуславливается совокупным действием двух молекулярных систем: индукционной и эффекторной. Первый блок отвечает за контролируемый запуск ЗГК. В него входят так называемые рецепторы смерти, Cys-Asp-протеазы (каспазы), ряд митохондриальных компонентов и проапоптических белков. Все элементы индукционной фазы можно разделить на тригеры (участвуют в индукции) и модуляторы, обеспечивающие трансдукцию сигнала смерти.

Эффекторную систему составляют молекулярные инструменты, обеспечивающие деградацию и перестройку клеточных компонентов. Переход между первой и второй фазами осуществляется на этапе протеолитического каспазного каскада. Именно за счет компонентов эффекторного блока происходит гибель клетки при апоптозе.

Факторы апоптоза

Структурно-морфологические и биохимические изменения при апоптозе осуществляются определенным набором специализированных клеточных инструментов, среди которых наиболее важными являются каспасы, нуклеазы и мембранные модификаторы.

Каспазы - группа ферментов, разрезающих пептидные связи по остаткам аспарагина, фрагментируя белки на крупные пептиды. До начала апоптоза присутствуют в клетке в неактивном состоянии из-за ингибиторов. Главной мишенью каспаз являются ядерные белки.

Нуклеазы - ответственны за разрезание молекул ДНК. Особо важна в развитии апоптоза активная эндонуклеаза CAD, разрывающая участки хроматина в областях линкерных последовательностей. В результате образуются фрагменты длиной 120-180 нуклеотидных пар. Комплексное воздействие протеолитических каспаз и нуклеаз приводит к деформации и фрагментации ядра.

Модификаторы клеточной мембраны - нарушают асимметричность билипидного слоя, превращая его в мишень для фагоцитирующих клеток.

Ключевая роль в развитии апоптоза принадлежит каспазам, которые поэтапно активируют все последующие механизмы деградации и морфологической перестройки.

Роль каспаз в клеточной гибели

Семейство каспаз включает 14 белков. Часть из них не задействована в апоптозе, а остальные подразделяются на 2 группы: инициаторные (2, 8, 9, 10, 12) и эффекторные (3, 6 и 7), которые иначе называются каспазами второго эшелона. Все эти белки синтезируются в виде предшественников - прокаспаз, активируемых протеолитическим расщеплением, суть которого состоит в отсоединении N-концевого домена и разделении оставшейся молекулы на две части, в последствии ассоциирующиеся в димеры и тетрамеры.

Инициаторные каспазы необходимы для активации эффекторной группы, которая проявляет протеолитическую активность в отношении различных жизненно важных клеточных белков. К субстратам каспаз второго эшелона относятся:

ферменты репарации ДНК;
игибитор белка р-53;
поли-(ADP-рибозо)-полимераза;
ингибитор ДНК-азы DFF (разрушение этого белка приводит к активации эндонуклеазы CAD) и др.

Общее количество мишеней эффекторных каспаз насчитывает более 60 белков.

Ингибирование апоптоза клеток еще возможно на стадии активации инициаторных прокаспаз. Когда эффекторные каспазы вступают в действие, процесс становится необратимым.

Пути активации апоптоза

Передача сигнала для запуска апоптоза клетки может быть осуществлена двумя путями: рецепторным (или внешним) и митохондриальным. В первом случае процесс активируется через специфические рецепторы смерти, воспринимающие внешние сигналы, которыми служат белки семейства TNF или Fas-лиганды, расположенные на поверхности Т-киллеров.

В состав рецептора входит 2 функциональных домена: трансмембранный (предназначенный для связи с лигандом) и ориентированный внутрь клетки "домен смерти", индуцирующий апоптоз. Механизм рецепторного пути основывается на образовании DISC-комплекса, активирующего инициаторные каспазы 8 или 10.

Сборка начинается со взаимодействия домена смерти с внутриклеточными адапторными белками, которые, в свою очередь, связывают инициаторные прокаспазы. В составе комплекса последние превращаются в функционально-активные каспазы и запускают дальнейший апоптозный каскад.

Механизм внутреннего пути основан на активации протеолитического каскада особыми митохондриальными белками, выброс которых контролируется внутриклеточными сигналами. Выход компонентов органоидов осуществляется через образование огромных пор.

Особая роль в запуске принадлежит цитохрому с. Попадая в цитоплазму, этот компонент электротранспортной цепи связывается с белком Apaf1 (апоптотический фактор активации протеаз), что приводит к активации последнего. Затем Apaf1 связывают инициаторные прокаспазы 9, которые по механизму каскада запускают апоптоз.

Контроль внутреннего пути осуществляется особой группой белков семейства Bcl12, которые регулируют выход межмембранных компонентов митохондрий в цитоплазму. В составе семейства имеются как проапоптические, так и антиапоптические белки, баланс между которыми и определяет, будет ли запущен процесс.

К одним из мощных факторов, запускающих апоптоз по митохондриальному механизму, относятся реактивные формы кислорода. Еще одним значимым индуктором является белок р53, который активирует митохондриальный путь при наличии ДНК-повреждений.

Иногда запуск апоптоза клеток сочетает в себе сразу два пути: как внешний, так и внутренний. Последний обычно служит для усиления рецепторной активации.

CAD (caspase activated DNase) на фрагменты размером, кратным 180-200 нуклеотидам . В результате апоптоза происходит образование апоптичних телец - мембранных везикул , содержащих целостные органеллы и фрагменты ядерного хроматина . Эти тельца поглощаются соседними клетками или макрофагами в результате фагоцитоза . Так как внеклеточный матрикс не поражается клеточными ферментами , даже при большом количестве апоптозных клеток, воспаление не наблюдается.

Процесс апоптоза является необходимым для физиологического регулирования количества клеток организма, для уничтожения старых клеток, для формирования лимфоцитов , которые не являются реактивными к своим антигенов (аутоантигенов), для осеннего опадения листьев растений , для цитотоксического действия Т-лимфоцитов киллеров, для эмбрионального развития организма (исчезновение кожных перепонок между пальцами у эмбрионов птиц) и других.

1. Значение апоптоза

Апоптоз - неотъемлемая часть жизнедеятельности большинства многоклеточных организмов. Особенно важную роль он играет в процессах развития. Например конечности четвероногих закладываются как лопатообразные вырасти, а формирование пальцев происходит благодаря гибели клеток между ними. Также подлежат апоптоза больше не нужны клетки, таким образом частности разрушается хвост у головастиков при метаморфозу. В нервной ткани позвоночных во время эмбрионального развития более половины нейронов погибают путем апоптоза сразу же после образования .

Также апоптоз является частью системы контроля за "качеством" клеток, он позволяет разрушать те из них, которые неправильно расположены, поврежденные, нефункциональные или потенциально опасные для организма. Примером могут служить и B-лимфоциты , которые погибают, если не несут полезных антиген -специфических рецепторов или несут автореактивни. Путем апоптоза также умирает большинство лимфоцитов аткивованих при инфекции после его преодоления .

У взрослых организмов одновременная регуляция пролиферации клеток и апоптоза позволяет поддерживать стали размеры целой особи и ее отдельных органов. Например, после вживавання препарата фенобарбитал , что стимулирует пролиферацию гепатоцитов, у крыс увеличивается печень . Однако, сразу же после прекращения действия этого вещества все лишние клетки подлежат апоптоза, в результате чего размер печени возвращается к нормальному .

Также апоптоз происходит, когда клетка "чувствует" большое количество внутренних повреждений, которые она не может репаруваты. Например, в случае повреждения ДНК клетка может трансформироваться в раковую, чтобы этого не произошло она, при нормальных условиях, "кончает жизнь самоубийством". Также погибает путем апоптоза большое количество клеток инфицированных вирусами .

2. Маркеры апоптических клеток

Маркеры апоптоза

Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках методом TUNEL Препарат ткани печени мыши, ядро апоптичнои клетки имеет коричневую окраску, оптическая микроскопия.

Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках с помощью электрофореза в агарозном геле. Слева: ДНК выделенной из апоптических клеток - видно "лесенку ДНК"; посередине: маркеры; дело: контрольный образец ДНК из необработанных клеток. Клеточная линия H4IIE (гепатома крыс), индуктором апоптоза - паракват, визуализация с помощью етидий бромида.

Сверху: выявление конденсации и фрагментации хроматина путем закрашивания флуоресцентным красителем (Hoechst 34580). Посередине: выявление транслокации фосфадидилсерину в наружный листок плазмалемме путем закрашивания аннексином V. Снизу: Микрофотография апоптических клеток в светлом поле. Клеточная линия - Jurkat, индуктор апоптоза - TRAIL, конфокальной и свитлопильна оптическая микроскопия .

Клетки, погибают путем апоптоза, можно распознать по ряду морфологических признаков. Они становятся меньше и более плотными (пикноз), округляются и теряют псевдоподии , в них разрушается цитоскелет , распадается ядерная мембрана , хроматин конденсируется и фрагментируется. На поверхности клеток появляется большое количество пузырьков, если клетки достаточно велики, то они распадаются на окружены мембранами фрагменты - апоптические тельца .

В апоптичних клетках кроме морфологических происходит также большое количество биохимических изменений. Частности ДНК разрезается специальными нуклеазами в линкерних участках между нуклеосомы на фрагменты равной длины. Поэтому при разделении всей ДНК апоптичнои клетки с помощью электрофореза можно наблюдать характерную "лесенку". Другой метод выявления фрагментации ДНК - метки ее свободных концов с помощью метода TUNEL ( T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling ) .

Изменения претерпевает также и плазматическая мембрана апоптичних клеток. При нормальных условиях отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин содержится только в ее внутреннем (возвращенном к цитозоля) слое, однако во время апоптоза он "перескакивает" в наружный листок. Эта молекула служит сигналом "съешь меня" для ближних фагоцитов . Фосфатидилсерин-индуцированное поглощение апоптических клеток, в отличие от других типов фагоцитоза, не приводит к выделению медиаторов воспаление . Описанная изменение плазмалемме лежит в основе еще одного метода выявления клеток, погибающих путем апоптоза - окрашивание анексином V, специфически связывается с фосфатидилсерина .

3. Каспаз - медиаторы апоптоза

Клеточные системы, которые обеспечивают прохождение апоптоза, аналогичные у всех животных, центральное место в них занимает семья белков каспаз. Каспаз - это протеазы , имеющие в активном центре остаток цистеина , и разрезают свои субстраты по специфическому остатка аспарагиновой кислоты (отсюда название: c от cysteine и asp от aspartic acid ). Каспазы синтезируются в клетке в виде неактивных прокаспаз, которые могут становиться субстратами для других, уже активированных каспаз, что режут их в одном или двух местах по остатку аспартата. Два образованы фрагменты - больший и меньший - соединяются между собой, формируя димер, что ассоциирует с таким же диммером. Сформированный таким образом тетрамер и является активной протеазой, что может разрезать белки-субстраты. Кроме участков, соответствующих большей и меньшей субъединиц, прокаспазы иногда также содержат ингибиторные продомены, которые деградируют после отщепления.

В результате расщепления и активации одних каспаз другими формируется протеалитичний каскад, который существенно усиливает сигнал и делает апоптоз с определенного момента необратимым процессом. Те прокаспазы, которые начинают этот каскад называются инициаторным, а их сусбтраты - эффекторными. После аткивации эффекторные каспазы могут расщеплять другие эффекторные прокаспазы или белки-мишени. До мишеней эффекторных каспаз, которые разрушаются во время апоптоза относятся в частности белки ядерной ламины, розщелення которых приводит к распаду этой структуры. Также деградирует белок, при нормальных условиях подавляет эндонуклеазы CAD, вследствие этого начинается фрагментация ДНК. Расщепляются каспаз и белки цитоскелета и межклеточной адгезии , вследствие чего апоптические клетки округляются и отсоединяются от соседних клеток, и таким образом становятся легче мишенью для фагоцитов .

Набор каспаз, необходимый для прохождения апоптоза зависит от типа ткани и пути, по которому активируется клеточная смерть. Например у мышей при "выключении" гена, кодирующие эффекторные каспазы-3, апоптоз не происходит в мозге, однако нормально протекающей в других тканях .

Гены прокаспаз активны в здоровых клетках, а следовательно белки необходимы для протекания апоптоза постоянно присутствующие, нужна лишь их активация для запуска клеточного суицида. В состав инициаторных прокаспаз входит длинный продомен, содержащий CARD ( caspase recruitment domain , Домен привлечения каспаз). CARD позволяет инициаторным прокаспазы присоединяться к адаптерных белков образуя активационные комплексы, когда клетка получает сигнал, что стимулирует апоптоз. В активационных комплексах несколько молекул прокаспаз оказываются непосредственно вблизи друг друга, чего достаточно для их перехода в активное состояние, после чего они разрезают друг друга .

Два лучше изучены сигнальные пути активации каскада каспаз в клетках млекопитающих называются внешний и внутренний (митохондриальный), каждый из них использует собственные инициаторным прокаспазы .

4. Пути активации апоптоза

4.1. Внешний путь

Клетка может получать сигнал, индуцирующего апоптоз, извне, например, от цитотоксических лимфоцитов. В таком случае активируется так называемый внешний путь ( extrinsic pathway ), Начинающийся с рецепторов смерти. Рецепторы смерти - это трансмембранные белки , принадлежащие к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (ФНО), например сам рецептор ФНО и рецептор смерти Fas. Они формируют гомотримеры, в которых каждый мономер имеет внеклеточный лиганд-Связной домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен смерти, через адаптерные белки привлекает и активирует прокаспазы .

Лиганды рецепторов смерти также гомотримерамы. Они родственны между собой и принадлежат к семейству сигнальных молекул фактора некроза опухолей. Например, цитотоксические лимфоциты несут на своей поверхности лиганды Fas, которые могут присоединяться к рецепторам смерти Fas на плазмалемме клеток-мишеней. В таком случае внутриклеточные домены этих рецепторов соединяются с адаптерного белка ( FADD, Fas-associated death domain ), А те в свою очередь привлекают инициаторным прокаспазы 8 и / или 10. Вследствие этой серии событий формируется сигнальный комплекс, индуцирующего смерть, - DISC ( death inducing signaling complex ). После активации в этом комплексе инициаторным каспазы разрезают эффекторные прокаспазы и запускают апоптичнои каскад .

Многие клетки синтезируют молекулы, в определенной степени защищают их от активации внешнего пути апоптоза. Примером такой защиты может быть экспрессия так называемых рецепторов-приманок ( decoy receptors ), Имеющих внеклеточные домены связывания лигандов, однако не цитоплазматических доменов сметри, а следовательно не могут запускать апоптоза и конкурируют с обычными рецепторами смерти за лиганды. Клетки также могут продуцировать белки, блокирующие внешний путь апоптоза, например FLIP, похожий по структуре прокаспаз 8 и 10, однако не протеалитичнои активности. Он подавляет связывание инициаторных прокаспаз с комплексом DISC .

4.2. Внутренний путь

Апоптосома

Апоптоз также может запускаться изнутри клетки, например в случае ее травмирования, повреждения ДНК, недостатка кислорода , питательных веществ или внеклеточных сигналов выживания. У позвоночных этот сигнальный путь называется внутренним ( intrinsic pathway ) Или митохондриальной, ключевым событием в нем является высвобождение определенных молекул с межмембранном пространстве митохондрий. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умов входить до електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію - приєднується до адаптерного білка Apaf ( apoptotic protease actiuating factor-l ), Вызывая его олигомеризации в колесоподибну семичленну структуру, которая называется апоптосома. Апоптосома привлекает и активирует инициаторным прокаспазу-9, которая затем может активировать инициаторным прокаспазы .

4.2.1. Регуляция внутреннего пути белками семьи Bcl-2

К семейству Bcl-2 относятся эволюционно консервативны белки, главной функцией которых является регуляция высвобождения цитохрома c и других молекул с мижмебранного пространства митохондрий. Среди них есть про-апоптические и анти-апоптические молекулы, которые могут взаимодействовать между собой в различных комбинациях, подавляя друг друга, баланс между их активностью и определять судьбу клетки .

Сейчас известно около 20 белков из этой семьи, все они содержат хотя бы один из четырех альфа-спиральных доменов гомологии Bcl2, называемых BH1-4 ( bcl2 homology ). Антиапоптични белки семьи Bcl2 содержат все четыре домены, к ним относятся сам Bcl-2, а также Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 и A1. Проапоптични белки делятся на две группы, члены первой из которых содержат три BH-домены (BH1-3), это в частности Bak, Bax и Bok (последний экспрессируется только в тканях репродуктивных органов). Наиболее многочисленной среди семьи Bcl-2 является вторая группа проапоптичних белков, которые содержат только домен BH3 (BH3-only), к ней относятся Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma .

При нормальных условиях (т.е. когда клетка не проходит апоптоза) антиапоптични белки, такие как Bcl-2 и Bcl-X L, связываются с проапоптичнимы белками BH123 (Bax и Bak) и не позволяют им полимеризоваться во внешней мембране митохондрий образуя поры. В результате действия определенного апоптичнои стимула в клетке активируются или начинают синтезироваться проапоптични белки, содержащие только домен BH3. Они в свою очередь ингибируют антиапоптични белки, снимая угнетающее действие на Bak и Bax, либо напрямую взаимодействуют с последними и способствуют их олигомеризации и образованию пор. Вследствие пермеабилизации наружной мембраны в цитозоль попадает цитохром c , а также другие медиаторы апоптоза, такие как AIF (англ. apoptosis inducing factor ).

Например, при недостатке сигналов выживания в клетке при посредничестве MAP-киназы JNK активируется экспрессия BH3 белка Bim, запускающий внутренний путь апоптоза. В случае повреждения ДНК происходит накопление супрессора опухолей p53 , который стимулирует транскрипцию генов, кодирующих BH3 белки Puma и Noxa, которые также обеспечивают прохождение апоптоза. Еще один BH3 белок - Bid обеспечивает связь между внешним и внутренним путями апоптоза. После активации рецепторов смерти и, как следствие, каспазы-8, последняя разрезает Bid с образованием усеченной формы tBid (truncated Bid), которая перемещается в митохонрий, где подавляет Bcl-2 .

Существуют два хорошо охарактеризованных пути апоптоза: с участием рецепторов клеточной гибели (внешний путь) и с участием митохондрий (собственный путь)

Активация каспаз и апоптоз индуцируются связыванием специфических лигандов из группы TNF со своими рецепторами (рецепторы клеточной гибели)

У позвоночных активация каспаз происходит при различных путях . На рисунке ниже представлены два хорошо известных пути. Это путь с участием рецепторов клеточной гибели (который также называется внешний путь) и путь с участием митохондрий (собственный путь). Хотя между обоими путями имеется несколько существенных различий, они обладают чертой сходства, котороая заключается в том, что каждый включает этап активации инициирующей каспазы по механизму индуцированного сближения с последующей активацией эффекторных каспаз.

Вместе с тем, наблюдается некоторый перекрест между двумя механизмами , поскольку путь с участием рецепторов клеточной гибели может включать элементы митохондриального пути.

Представляют собой подгруппу относящихся к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR) позвоночных. Они включают TNFR1, Fas (также называемый CD95 или АРО-1) и TRAIL (TRAIL-R1, -R2 у человека, также называемые DR4 и DR5). На рисунке ниже представлены различные типы рецепторов клеточной гибели.

Эти тримерные рецепторы связываются со специфическими лигандами (TNF, Fas-лигандом или TRAIL соответственно) и могут быстро запускать в клетках процесс апоптоза. Лиганды продуцируются различными клетками, включая клетки иммунной системы, часто в ответ на факторы, вызывающие воспаление.

Рецепторы гибели клеток содержат домен смерти, расположенный внутри клетки. Эти домены, как и домены CARD, DED и PYR, представляют собой еще один пример складок смерти, и они взаимодействуют с доменами смерти в адаптерных молекулах.

Находятся на поверхности клеток в виде тримеров, и, вероятно, соответствующие лиганды располагаются в виде кластеров, которые связаны с двумя и более этих тримеров. Такое расположение делает рецепторы доступными для взаимодействия с внутриклеточными белками. После связывания между собой доменов гибели Fas/CD95 и рецепторов TRAIL, они ассоциируют с адаптерным белком FADD (Fas-associated death domain). Эта ассоциация возникает при участии домена гибели FADD белка.

При этом в клетке молекулы FADD сближаются, и становится доступным другой регион белка, содержащий DED.

Домен DED белка FADD теперь связывается с DED-участками продомена мономера каспазы-8, что приводит к образованию димеров и активации инициаторной каспазы по механизму индуцированного сближения. После связывания рецептора гибели быстро образуется комплекс, содержащий FADD (за счет взаимодействия с доменом гибели). FADD связан с каспазой-8 (за счет взаимодействия с DED). Это сигнальный комплекс, индуцирующий клеточную гибель (англ, death-inducing signaling complex, DISC).

Активированная каспаза-8 начинает расщеплять в клетке субстраты, включая эффекторные каспазы-3 и -7, и происходит апоптоз. На рисунке ниже представлена последовательность событий при развитии апоптоза с участием рецепторов клеточной гибели.

Известно много примеров апоптоза , происходящего с участием рецепторов клеточной гибели. Этот путь особенно характерен для функционирования эффекторов иммунной системы и для регуляции иммунных процессов. Внешний путь апоптоза также реализуется в клетках другого происхождения, включая нейроны. В настоящее время в качестве возможного противоопухолевого средства исследуется TRAIL, который обладает способностью индуцировать апоптоз в клетках некоторых опухолей.

В соответствии с установленной ролью Fas в иммунной системе у людей, а также у мышей, несущих мутации, затрагивающие Fas или его лиганд, наблюдается заболевание, при котором происходит массивное разрастание лимфатических органов. Это разрастание обусловлено накоплением измененной популяции Т-клеток. У больных также отмечаются аномалии В-лимфоцитов, включающие продуцирование аутоиммунных антител и развитие В-клеточных лимфом.

Представлены два пути реализации апоптоза у позвоночных.
Путь через рецепторы клеточной гибели (также носящий название внешний путь) запускается, когда специфические лиганды гибели, относящиеся к семейству TNF, находят свои рецепторы.
Митохондриальный путь (также называемый внутренним, или собственным, путем)
реализуется при нарушении проницаемости наружной мембраны митохондрий в результате взаимодействий белков семейства Bcl-2 и высвобождения межмембранных белков.
К числу последних относится цитохром С, который при взаимодействии с белками цитозоля запускает активацию каспаз.
Эти процессы подробно рассмотрены в последующих статьях на сайте.

Рецепторы клеточной гибели относятся к семейству TNF-рецепторов,
у которых со стороны клетки расположены домены клеточной гибели.
На поверхности многих типов клеток позвоночных эти рецепторы существуют в виде тримеров.

При связывании лиганда с рецептором клеточной гибели на поверхности клетки, адаптерный белок FADD присоединяется к нему с клеточной стороны.
Это происходит при взаимодействии доменов клеточной гибели (DD)-(DD).
Затем при участии эффекторных доменов клеточной гибели (DED)-(DED) к белку FADD присоединяется каспаза-8.
При димеризации каспазы-8 фермент активируется по механизму индуцированной близости.
Активная каспаза расщепляет и активирует эффекторные каспазы, которые вызывают апоптоз.
Комплекс, содержащий рецептор клеточной гибели, FADD и каспазу-8, называется сигнальным комплексом индукции клеточной гибели (DISC).